Les spectrophotomètres sont devenus des instruments de routine dans les laboratoires de biologie moléculaire modernes. Souvent utilisé pour l'acide nucléique, la quantification des protéines et la quantification des concentrations de croissance bactérienne.
Principe simple du spectrophotomètre
Le spectrophotomètre utilise une source de lumière pouvant générer plusieurs longueurs d'onde et passe à travers une série de dispositifs spectroscopiques afin de générer une source de lumière d'une longueur d'onde spécifique. Une fois que la source de lumière a traversé l'échantillon à tester, une partie de la source de lumière est absorbée et l'absorbance de l'échantillon est calculée, ce qui la convertit en une concentration d'échantillon. . L'absorbance de l'échantillon est proportionnelle à la concentration de l'échantillon.
Quantification des acides nucléiques
La quantification des acides nucléiques est la fonction la plus fréquemment utilisée du spectrophotomètre. Les oligonucléotides, ADN simple brin, double brin et ARN peuvent être quantifiés dans un tampon. Le pic d'absorption du pic d'absorption le plus élevé de l'acide nucléique est de 260 nm. La composition moléculaire de chaque acide nucléique étant différente, les facteurs de conversion sont donc différents. Pour quantifier différents types d'acides nucléiques, sélectionnez au préalable les coefficients correspondants. Par exemple, l'absorbance de 1 DO correspond à 50 µg / ml d'ADNd, 37 µg / ml d'ADNsb, 40 µg / ml d'ARN et 30 µg / ml d'Olig. L'absorbance après le test est convertie par les coefficients ci-dessus pour obtenir la concentration d'échantillon correspondante. Avant de tester, sélectionnez la procédure correcte, entrez le volume de la solution mère et du diluant, puis testez la solution à blanc et l’échantillon. Cependant, l'expérience n'a pas toujours été sans heurts. Des lectures instables peuvent constituer le plus gros mal de tête pour l'expérimentateur. Les instruments avec une sensibilité plus élevée montrent une plus grande dérive d'absorbance.
En fait, le principe de conception et le principe de fonctionnement du spectrophotomètre permettent de faire varier l’absorbance dans une certaine plage, c’est-à-dire que l’instrument a une précision et une précision données. Par exemple, la précision du biophotomètre Eppendorf est ≤ 1,0% (1A). Les résultats de ces tests multiples varient entre environ 1,0% de la moyenne et sont normaux. En outre, il est également nécessaire de prendre en compte les propriétés physicochimiques de l'acide nucléique lui-même et le pH du tampon dans lequel l'acide nucléique est dissous, la concentration en ions, etc.: lorsque la concentration en ions est trop élevée pendant l'essai, Il est donc recommandé d’utiliser une certaine valeur de pH et une faible concentration en ions. Les tampons, tels que TE, stabilisent grandement les lectures. La concentration de dilution de l'échantillon est également un facteur qui ne peut être ignoré: en raison de la présence inévitable de particules fines, notamment des échantillons d'acide nucléique, dans l'échantillon. La présence de ces petites particules interfère avec les résultats du test. Afin de minimiser l’effet des particules sur les résultats du test, l’absorbance de l’acide nucléique doit être au moins supérieure à 0,1 A, et l’absorbance est de préférence comprise entre 0,1 et 1,5 A. Dans cet intervalle, l’interférence de la les particules sont relativement petites et le résultat est stable.
Cela signifie que la concentration de l'échantillon ne doit être ni trop basse ni trop élevée (au-delà de la plage de test du photomètre). Enfin, les facteurs de fonctionnement, tels que le mélange, devraient être suffisants, sinon la valeur d'absorbance est trop faible, même des valeurs négatives; le mélange ne peut pas exister de bulles, le liquide vierge n'a pas de matière en suspension, sinon la lecture dérive radicalement; la même cuvette doit être utilisée pour tester le blanc et l'échantillon, sinon la différence de concentration est trop grande; le facteur de conversion et l'unité de concentration de l'échantillon sont sélectionnés de manière cohérente; la cuvette avec des vitres ne peut pas être utilisée; le volume de l'échantillon doit atteindre le volume minimal requis par la cuvette.
Outre la concentration en acides nucléiques, le spectrophotomètre indique également plusieurs ratios très importants indiquant la pureté de l'échantillon, tels que le ratio de A 260 / A 280, utilisés pour évaluer la pureté de l'échantillon car le pic d'absorption de la protéine est 280 nm. Un échantillon pur avec un rapport supérieur à 1,8 (ADN) ou 2,0 (ARN). Si le rapport est inférieur à 1,8 ou 2,0, cela indique la présence de protéines ou de substances phénoliques. Un 230 indique que certains contaminants sont présents dans l'échantillon, tels que des glucides, des peptides, des phénols, etc., et que le rapport de l'acide nucléique plus pur A 260 / A 230 est supérieur à 2,0. A 320 détecte la turbidité de la solution et d’autres facteurs d’interférence. Pour les échantillons purs, A 320 est généralement égal à 0.
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