Quantification protéique colorimétrique spectrophotométrique
Les protéines sont généralement un mélange de protéines. Les dosages colorimétriques sont basés sur les constituants protéiques: Les acides aminés (par exemple, la tyrosine, la sérine) réagissent avec un groupe ou un colorant chromogène supplémentaire pour produire un matériau coloré. La concentration du matériau coloré est directement liée au nombre d'acides aminés que la protéine réagit, reflétant ainsi la concentration en protéines.
Méthode colorimétrique
Il existe plusieurs méthodes telles que BCA, Bradford et Lowry.
La méthode Lowry: basée sur la première réaction de Biuret et améliorée. La protéine réagit avec Cu2 pour produire une réaction bleue. Cependant, la méthode de Lowry est plus sensible que Biuret. L'inconvénient est la nécessité d'ajouter séquentiellement plusieurs réactifs différents; la réaction prend beaucoup de temps; est sensible aux substances non protéiques; les protéines contenant de l'EDTA, du Triton x-100 et du sulfate d'ammoniaque ne conviennent pas pour cette méthode.
Dosage de l'acide de bicinchoniinine: Il s'agit d'un dosage protéique plus récent et plus sensible. La protéine à analyser réagit avec Cu2 dans une solution alcaline pour produire du Cu, qui forme un chélate avec BCA pour former un composé violet avec un pic d'absorption à 562 nm. La relation linéaire entre la concentration de ce composé et la protéine est forte, et le composé formé après la réaction est très stable. Par rapport à la méthode de Lowry, l'opération est simple et la sensibilité est élevée. Cependant, semblable à la méthode de Lowry, il est susceptible d'interférer avec les protéines et les détergents.
La méthode de Bradford: Le principe de cette méthode est que la protéine réagit avec Coomassie Brilliant Blue pour produire un composé coloré qui absorbe à 595 nm. Sa plus grande caractéristique est sa sensibilité, qui est 2 fois celle de Lowry et BCA. C'est plus simple et plus rapide. Il nécessite seulement un type de réactif de réaction. Le composé peut être stable pendant 1 heure pour faciliter le résultat; Interférant avec Lowry, BCA réagit avec les agents réducteurs (par exemple DTT, mercaptoéthanol) compatibles. Cependant, il est encore sensible aux détergents. Le principal inconvénient est que différentes normes peuvent conduire à de grandes différences dans les résultats du même échantillon et aucun résultat comparable.
Certains chercheurs exposés pour la première fois à des mesures colorimétriques peuvent être perturbés par les résultats des différents tests colorimétriques. Quel genre de méthodes croyez-vous être confus? Du fait que les groupes ont réagi de différentes manières et que les groupes chromogènes ne sont pas identiques, plusieurs méthodes sont utilisées simultanément pour rendre incohérentes les concentrations d'échantillon du même échantillon. Par exemple, Keller et al. testé la protéine dans le lait humain et a constaté que les concentrations mesurées par Lowry et BCA étaient significativement plus élevées que celle de Bradford. La différence était significative. Même si le même échantillon est déterminé, l'échantillon standard sélectionné par la même méthode colorimétrique est incohérent et la concentration après le test est également incohérente. Par exemple, utiliser Lowry pour tester la protéine dans l'homogénat cellulaire, en utilisant BSA comme standard, avec une concentration de 1,34 mg / ml, et une globuline en tant que norme avec une concentration de 2,64 mg / ml. Par conséquent, avant de sélectionner une méthode colorimétrique, il est préférable de se référer à la composition chimique de l'échantillon à tester et de trouver une protéine standard chimiquement similaire comme standard. En outre, la méthode colorimétrique pour quantifier les protéines pose souvent des problèmes en ce sens que la valeur d'absorbance de l'échantillon est trop faible, ce qui entraîne une grande différence entre la concentration d'échantillon mesurée et la concentration réelle. La question clé est que la couleur de la partie importante du spectrophotomètre 1011, la cuvette, a une certaine demi-vie, de sorte que chaque méthode colorimétrique énumère le temps du test de réaction. Tous les échantillons (y compris les échantillons standard) doivent être testés dans ce délai. Si le temps est trop long, la valeur d'absorbance obtenue devient plus petite et la valeur de concentration convertie diminue. En outre, la température de réaction, la valeur de pH de la solution, etc. sont tous des facteurs importants qui affectent l'expérience. En outre, il est très important d'utiliser la colorimétrie plastique. Évitez d'utiliser des cuvettes en quartz ou en verre, car la couleur après la réaction entraînera la coloration du quartz ou du verre, ce qui entraînera une absorption imprécise de l'échantillon.
L'entreprise se spécialise dans la vente de spectrophotomètres , accueille les clients qui ont besoin de consulter et d'acheter, nous vous fournirons un service sincère et des produits de qualité, ainsi que des prix plus bas.
E-mail: info@sumerlab.com
Web: sumerinstrument.com