Quantification des acides nucléiques dansSpectrophotomètres
La quantification des acides nucléiques est la fonction utilisée plus fréquemment d’unspectrophotomètre.Oligonucléotides, simple brin, ADN double brin et l’ARN peuvent être quantifié dans les tampons. Le pic d’absorption du plus haut sommet de l’absorption de l’acide nucléique est 260 nm. Chaque acide nucléique a une composition moléculaire différente et a donc les différents facteurs de conversion. Afin de quantifier les différents types d’acides nucléiques, sélectionner les coefficients correspondants à l’avance. Par exemple, l’absorption du 1OD est équivalente à 50 μg/ml dsDNA, 37 ADNsb μg/ml, 40 μg/ml ARN et 30 μg/ml Olig, respectivement. La valeur d’absorbance après que l’essai est transformé par le coefficient ci-dessus pour obtenir la concentration de l’échantillon correspondant. Avant l’essai, sélectionnez la procédure correcte, entrez les volumes de la solution mère et diluant et tester le flan et déguster des solutions. Toutefois, l’expérience n’a pas été facile. Des lectures instables est peut-être le plus grand mal de tête pour les expérimentateurs. Plus la sensibilité de l’instrument, plus l’absorbance expose la dérive.
En fait, le principe de conception et principe de fonctionnement de laspectrophotomètrepermettre à la valeur d’absorbance à modifier dans une certaine plage, c'est-à-dire, l’instrument a un certain degré de précision et d’exactitude. Comme Eppendorf Biophotometer précision ≤ 1,0 % (1 a). Les résultats de ces tests multiples varient entre la moyenne de 1,0 % et sont tous normaux. En outre, les propriétés physico-chimiques de l’acide nucléique, le pH de la mémoire tampon pour dissoudre l’acide nucléique, la concentration en ions, etc. doit également tenir compte : lors de l’essai, trop élevée une concentration de l’ion entraînera aussi la lecture à la dérive comme TE , qui se stabilisera grandement la lecture. La concentration de l’échantillon de dilué est également un facteur non négligeable : en raison de la présence inévitable de petites particules dans l’échantillon, en particulier l’acide nucléique échantillons. La présence de ces petites particules interfère avec l’effet de l’essai. Afin de minimiser l’influence des particules sur les résultats des tests, l’absorption de l’acide nucléique est nécessaire au moins 0,1 A et l’absorbance est préférablement 0,1 à 1,5 A. Dans cette gamme, il ne doit y avoir aucuns bulles dans le mélange, et il n’y a pas de suspension dans le vide. Dans le cas contraire, les lectures dérivent violemment ; la même tasse colorimétrique doit être utilisée pour tester le blanc et l’échantillon ; dans le cas contraire, la différence de concentration est trop importante ; le coefficient de conversion et de l’unité de concentration d’échantillonnage sont les mêmes ; La cupule portée par la fenêtre ; le volume de l’échantillon doit atteindre plus que le volume minimum requis de la coupe de couleur, etc..
En plus de la concentration d’acide nucléique, laspectrophotomètremontre plusieurs rapports très importants en même temps pour indiquer la pureté de l’échantillon, comme le ratio A260/A280, aux fins d’évaluer la pureté de l’échantillon, puisque le pic d’absorption de la protéine est de 280 nm. Échantillons purs ont un taux supérieur à 1,8 (ADN) ou 2.0 (RNA). Si le ratio est inférieur à 1.8 ou 2.0, il indique la présence de protéines ou de substances phénoliques. A230 indique qu’il y a certains contaminants dans les échantillons, tels que les hydrates de carbone, les peptides, les phénols, etc.. Le ratio d’acide nucléique pur A260/A230 est supérieure à 2.0. A320 détecte la turbidité de la solution et d’autres facteurs de perturbation. Échantillon pur, A320 est généralement 0.
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